ریز ازدیادی گونه زینتی Eucalyptus gunnii در شرایط in vitro

محمد حسن عصاره[1][1] و حسین سردابی¹

چکیده

     نقش گونه E. gunnii به عنوان درخت زینتی در فضای سبز و استفاده از شاخ و برگ جوان آن در دکور دسته های گل، شهرت فراوان دارد. این شهرت مدیون رنگ سبز کبود، شکل قلبی تا دایره ای برگها، زنده مانی قابل توجه شاخ و برگها در داخل گلدان، بردباری زیاد آن به سرما و تاج جذاب و گسترده آن می باشد. تکثیر غیر جنسی این گونه از طریق روشهای معمول، به خصوص در تولید ریشه های نابجا مشکل می باشد. ازدیاد پایه هایی با خصوصیات برتر از طریق کشت بافت بسیار حائز اهمیت و کاربردی می باشد. در این تحقیق ریزنمونه از اندامهای مختلف گیاه، از جمله جوانه های جانبی شاخه های جوان، جوانه های گل، غده های لیگنینی شده و از جوانه های اپی کورمیک انتخاب گردید. تیمارهای مختلف برای استریل کردن نمونه ها و نیز برای کنترل مواد مترشحه فنولیک استفاده شد. محیط کشت De-Fossard، WPM و MS تغییر یافته برای مراحل استقرار و پرآوری بکار گرفته شد. در مرحله پرآوری و ریشه زایی غلظتهای مختلف سیتوکینین-اکسین به صورت تیمارهای مختلف، مورد آزمایش قرار گرفتند. نتایج به دست آمده نشان داد که افزایش غلظت هیپوکلرید کلسیم و یا هیپوکلرید سدیم از طرفی منجر به کاهش آلودگی سطحی، و از طرف دیگر باعث افزایش مواد فنلی در محیط کشت می شود. تغییرات فصلی نیز در ترشح مواد مذکور مؤثر می باشد. استفاده از اسید اسکوربیک و اسید سیتریک و قراد دادن کشت ها در تاریکی با زیر کشت نمودن متعدد، در کاهش یا حذف مواد مضر مذکور، تعیین کننده است. بهترین ریزنمونه برای این گونه گیاهی استفاده از جوانه های تحریک شده اپی کورمیک است. محیط کشت De-Fossard نسبت به سایر ترکیبات، درصد زنده مانی بیشتری را نشان داد. هورمونهای kinetin با غلظت 5/0 میلی گرم در لیتر و NAA با غلظت 01/0 میلی گرم در لیتر، بیشترین ازدیاد جوانه و کمترین تولید کالوس را همراه داشت. بیشترین درصد ریشه دهی (5/62 درصد) با استفاده از ترکیب IBA و NAA به دست آمد. افزایش زیرکشت ها در مرحله شاخه دهی منجر به افزایش درصد ریشه دهی می شود. پس از تولید گیاهک های ریشه دار، مراحل سازگاری و انتقال به گلخانه با 2/75 درصد زنده مانی انجام شد.

مقدمه:

این گونه اکالیپتوس که در استرالیا به Cider gum شهرت دارد در ناحیه خزری یا سایر مناطقی که دارای میانگین بارندگی سالیانه معادل 750 تا 1500 میلیمتر و حد اکثر سه ماه دوره خشکی (با شدت کم)        می باشند، قابل کاشت است، بردباری آن نسبت به سرما زیاد است (100 تا 150 روز یخبندان و با میانگین دمای صفر یا کمتر در سردترین ماههای سال) و درختی است زینتی زیرا جزو گیاهان همیشه سبز به شمار می آید، دارای تاج جذاب و گسترده و برگهایی به رنگ سبز کبود و به شکل قلبی تا دایره ای است (Anonymous، 1981 و Allemand وBerninger، 1985)، جهت ایجاد فضای سبز در مناطق خنک (حد اقل مطلق دما در حدود 6- درجه سانتیگراد) مناسب است (Robinson، 1992 و Muir، 1978) و از شاخ و برگهای جوان آن برای تزیین و دکور دسته های گل استفاده می شود (Barnard، 1963).

     شاخ و برگهای بریده شده E. gunnii که تحت دو تیمار دو و چهار هفته نگهداری در سردخانه در دمای پنج درجه سانتیگراد قرار داشتند، میانگین زنده مانی گلدانی آنها بعد از خروج از سردخانه و در دمای سه تا شش درجه سانتیگراد، به ترتیب معادل 31 تا 59 و 32 تا 69 روز بود. میزان زنده مانی گلدانی ساقه ها در شرایط سردخانه خشک بیش از حالت مرطوب بود. ساقه هایی که به مدت دو هفته در سردخانه با دمای پنج درجه سانتیگراد نگه داری شده بودند، زنده مانی گلدانی آنها در دمای 16 تا 18 درجه سانتیگراد  نسبت به ساقه هایی که به صورت تازه تهیه شده بودند، بیشتر بود. در میان هشت گونه مورد آزمایش که اغلب آنها اکالیپتوس بودند، گونه E. gunnii دارای بیشترین توان از نظر زنده مانی گلدانی بود ( Forrest، 1991). Bazzocchi و همکاران (1987) از میان 22 گونه اکالیپتوس مورد آزمایش، هشت گونه منجمله  gunnii E. دارای بالاترین ارزش تجاری از نظر تولید شاخ و برگ بودند و در ضمن همه گونه ها توانستند در دمای اطاق و در داخل آب گلدان به مدت حد اقل 30 روز تازه بمانند. در آزمایشی دیگر از میان 11 گونه اکالیپتوس،‌ گونه E. gunnii به همراه چهار گونه همتراز دارای بهترین خصوصیات کیفی از نظر تولید شاخ و برگ بود (‍ Rumineو Bellandi، 1989).

در ایران تعداد اندکی از پایه های این گونه وجود دارد و صنعت گل و گیاه در کشور از این گونه کمتر بهره جسته است. ازدیاد هم گروه این گونه از طریق روشهای متداول باغبانی، به خصوص در تولید ریشه های نابجا در قلمه ها مشکل و یا غیر ممکن است. به دلیل وجود مواد ممانعت کننده در اندامهای مسنتر، عمل پیوند به دلیل عدم پذیرش پیوندک در روی پایه، ناموفق بوده است. بنابراین یکی از اهداف مهم این تحقیق تکثیر گیاه با روشهای جدید کشت بافت و تولید انبوه گیاهچه های هم گروه (clone) در این گونه زینتی  می باشد که می تواند بسیار حائز اهمیت و به عنوان بستر مناسب برای گلهای زینتی، کاربرد گسترده ای داشته باشد.

مواد و روشها

برای دستیابی به بهترین ریز نمونه، اندامهای مختلف از جوانه های جانبی شاخه های جوان، غده های لیگنینی شده، جوانه های انتهائی و نیز جوانه های موسوم به اپی کورمیک مورد بررسی قرار گرفتند. با توجه به اینکه جوانه های اپی کورمیک فقط تحت شرایط خاص حاصل می شوند، لذا برای تهیه آنها از دو روش مستقیم و غیر مستقیم استفاده شد. در روش مستقیم پاجوشهای پایه های مادری شناسایی و پس از هرس سنگین آنها و مسدود کردن انتهای بریده شده با پارافین مایع، اتصال آنها به تنه اصلی حفظ شد و بعد از پانزده روز جوانه های ظاهر شده برداشت شدند. در روش غیر مستقیم، شاخه های جوان به طول 50 تا 70 سانتی متر و با قطر حدود 5/1 تا 3 سانتی متر قطع شدند و تحت رطوبت 75 تا 85 درصد در گلخانه نگهداری شدند و به طور مرتب توسط قارچ کش بنومیل با غلظت یک گرم در لیتر محلول پاشی شدند. با ظهور جوانه های اپی کورمیک بعد از حدود دو هفته، نسبت به برداشت آنها اقدام شد. تیمارهای متفاوتی با استفاده از مواد استریل کننده از جمله اتانول، هیپوکلرید سدیم و هیپوکلرید کلسیم با غلظتها و مدت زمانهای مختلف، بر ریز نمونه ها اعمال شدند.

     پس از اعمال تیمارها، جوانه های دارای طول حدود 10 تا 15 میلیمتر با حفظ دو برگچه جوان، در محیط کشت مقدماتی فاقد هورمون و حاوی ویتامین و سه درصد ساکاروز و 25 گرم در لیتر ژلرایت، قرار گرفتند. آلودگی کشتها پس از پنج هفته مورد بررسی و شمارش قرار گرفت.

     برای حذف یا کاهش مواد مترشحه فنولیک، علاوه بر بررسی فصل رویش گیاه، استفاده از برخی مواد آنتی اکسیدان و ایجاد تغییر در شرایط فیزیکی، مورد ارزیابی قرار گرفت. برای انتخاب بهترین محیط کشت پایه، از محیطهای WPM، DEU و MS (در این تحقیق به MS₁ و MS₂ تغییر یافت) استفاده شد.

     در مرحله شاخه زایی، سیتوکینینها در نوع و غلظت متفاوت و با مقدار ثابت اکسین و در مرحله ریشه زایی، از بهترین سیتوکینین حاصله در مرحله شاخه زایی با تغییر در نوع و غلظت اکسین، طی آزمایشهای متعدد استفاده شد. گیاهکهای ریشه دار شده پس از انتقال به شرایط رطوبتی زیاد، مراحل سازگاری و انتقال به خاک را سپری نمودند.

نتایج و بحث

پس از جمع آوری ریز نمونه ها، مراحل استریل نمودن آنها تحت تیمارهای مختلف انجام شد. نتایج نشان می دهد که آلودگی داخلی ناشی از میکروارگانیسمهای سیستمیک، در اولین هفته پس از کشت ظاهر شد که پس از شناسایی مشخص گردید که باکتری Bacillus lentus عامل این آلودگی داخلی است. آلودگی خارجی که در محیط کشت پدید می آید ناشی از فعالیت انواع ساپروفیتها، از جمله   گونه هایی از آسپرژیلوس، پنی سیلین و زیزیپوس و همچنین در برخی از کشتها، مخمر (yeast) بود. از شیشه های محتوی ریز نمونه بدون آلودگی و پاک، برای انجام سایر مراحل استفاده شد. مشاهدات مؤید این است که با افزایش غلظت هیپوکلرید سدیم، تعداد نمونه های آلوده کاهش، در حالی که مرگ و میر ریز نمونه ها در اثر تجمع مواد فنولیک افزایش می یابد. علاوه بر آن، با بکاربردن هیپوکلرید کلسیم شدت ترشح مواد فنولیک در مقایسه با بکارگیری هیپوکلرید سدیم کندتر بود، بنابراین در سایر مراحل از این ترکیب استفاده شد. در گزارش مشابهی Seneviratne و همکاران (1995) همین ادعا را داشته اند که با افزایش غلظت به میزان 5 تا 20 درصد و افزایش زمان به مقدار 5 تا 20 دقیقه با استفاده از هیپوکلرید سدیم و هیپوکلرید کلسیم، میزان آلودگی کاهش یافت ولی قهوه ای شدن محیط کشت در اثر ترشح مواد فنلی، افزایش یافت. براساس مشاهدات به عمل آمده در این تحقیق، برداشت نمونه در فصول گرمتر شدت ترشح مواد فنلی را افزایش می دهد.

     برای حذف و یا کاهش ترشح مواد فنلی در محیط کشت که در گونه های مختلف اکالیپتوس شایع     می باشد، با استفاده از برخی مواد آنتی اکسیدان و تغییر شرایط فیزیکی، آزمایشی صورت گرفت که نتایج آن در جدول شماره 1 ارائه شده است:

جدول شماره 1: تاثیر آنتی اکسیدانها و نیز شرایط فیزیکی محیطهای کشت به منظور کاهش مواد مترشحه فنلی^×

× حروف مشابه بیانگر عدم معنی دار بودن میانگینها از نظر آماری در سطح 5 درصد با استفاده از آزمون دانکن می باشد در ضمن اشتباه استاندارد به صورت ± نشان داده شده است

     نتایج به دست آمده نشان می دهد که تیمارهای مختلف در کاهش و یا خنثی سازی مواد مترشحه نقش داشته اند. علیرغم کاهش پدیده قهوه ای شدن در اثر استفاده از مواد PVP و اسید اسکوربیک و اسید سیتریک، ولی تعداد زیادی از نمونه ها در اثر قهوه ای شدن محیط کشت، طی مدت سه تا چهار هفته از بین رفتند. قرار دادن نمونه ها در تاریکی و نیز زیر کشت نمودن نمونه در محیط کشت تازه در چند هفته متوالی، اقدامی بسیار مؤثر بوده که منجر به حذف کامل یا بقای ابری از مواد فنلی شد و ریز نمونه ها با شادابی خوبی در این شرایط استقرار یافتند (جدول شماره 1). تحقیقات مشابهی توسط Gill و Gill (1994) انجام شد. علاوه بر تاثیر PVP و اسید اسکوربیک و اسید سیتریک، نگهداری کشتها در تاریکی و زیر کشت آنها در محیط کشت تازه در هر چهار روز یک بار، تاثیر شایان توجهی در شفاف نمودن کشتها از مواد فنلی داشته است.

     موفقیت در استقرار سیستم در کشت بافت، به انتخاب نوع ریز نمونه، محیط کشت مناسب و استفاده از نوع و غلظت هورمونهای رشد بستگی دارد. شکل شماره 1 میزان بقا و زنده مانی انواع ریز نمونه ها را نشان می دهد. مشابه این تحقیق که توسط Ikemori (1987) در مورد گونه E. grandis انجام شد، استفاده از جوانه های اپی کورمیک را توصیه نموده است، زیرا قدرت ایجاد جوانه های نابجا در آنها به دلیل برخورداری از هورمونهای طبیعی، زیاد بوده و به دلیل جوانی از آلودگی کمتری برخوردار می باشند، لذا ساده تر و سریعتر از سایر بافتها و جوانه ها می توانند در محیط کشت استقرار یابند. در سایر مراحل انجام این تحقیق، فقط از جوانه های اپی کورمیک استفاده شد.

     در بررسی انتخاب محیط کشت مناسب، با توجه به منابع متعدد بررسی شده، از چهار نوع محیط کشت به شرح جدول شماره 2 استفاده شد و نتایج آن به شرح زیر ارائه می شود:

جدول شماره 2 تاثیر محیط کشت بر زنده مانی ریز نمونه ها^×

× حروف مشابه بیانگر عدم معنی دار بودن میانگینها از نظر آماری در سطح 5 درصد با استفاده از آزمون دانکن می باشد

     محیط کشت DeFossard قبلا در کشت بافت برخی از گونه های اکالیپتوس از جمله گونه E. gunnii و   E. cicifolia به ترتیب توسط Curir و همکاران (1986) و DeFossard و همکاران (1978) به منظور تکثیر جوانه ها در مرحله شاخه زایی، از چهار نوع هورمون با غلظتهای مختلف و یک اکسین با غلظت ثابت (NAA 1/0 میلی گرم در لیتر) استفاده شد که نتایج در جدول شماره 3 قابل مشاهده است.

جدول شماره 3: تاثیر نوع و غلظت سیتوکینین به همراه NAA در غلظت 1/0 میلی گرم در لیتر جهت انتخاب بهترین غلظت برای مرحله شاخه زایی^×

× حروف مشابه بیانگر عدم معنی دار بودن میانگینها از نظر آماری در سطح 5 درصد با استفاده از آزمون دانکن می باشد

     کینتین با غلظت5/0 میلی گرم در لیتر از نظر آماری بهترین تولید جوانه را به تعداد 33/5 نسبت به سایر تنظیم کننده های رشد داشته و نیز همین غلظت، شاخه هایی با بنیه قویتر را تولید کرد. در میان سیتوکینینهای استفاده شده، TDZ میزان کالوس بیشتری را تولید کرد و تعدادی جوانه با برگ غیر طبیعی را ظاهر ساخت. بهترین غلظت کینتین به میزان 5/0 میلی گرم در لیتر با بکارگیری دو نوع اکسین شامل NAA و IBA، هر کدام در غلظتهای 01/0، 1/0 و 3/0 میلی گرم در لیتر، مورد استفاده قرار گرفت که بهترین ترکیب برای اکسین، استفاده از NAA به غلظت 01/0 میلی گرم در لیتر بود که تعداد 83/7 جوانه (ریز شاخه) را تولید کرد.

     برای ریشه دار نمودن ریز شاخه ها تیمارهای مختلفی استفاده شد که جزییات آنها به همراه نتایج به دست آمده در جدول شماره 4 ارائه می شود:

جدول شماره 4: تاثیر روشها و تیمارهای مختلف در ریشه دار نمودن ریز شاخه ها^×

× حروف مشابه بیانگر عدم معنی دار بودن میانگینها از نظر آماری در سطح 5 درصد با استفاده از آزمون دانکن می باشد

     نقش اکسین در تحریک ریشه زایی بسیار اساسی بوده، اما به طور معمول غلطت بالای آن منجر به تولید کالوس در قسمت پایه یا محل تولید ریشه می شود. غلظت کم آن نیز درصد ریشه زایی را کاهش  می دهد. همانگونه که در قسمت نتایج مشاهده می شود، بکار گرفتن به تنهایی یک نوع اکسین موجب کاهش درصد ریشه زایی شده در حالی که ترکیب دو نوع اکسین با غلظت کمتر، موجب افزایش تولید ریشه در گیاهکها به میزان 5/62 درصد شده است. این نتیجه توسط Cheng و همکاران (1992) در مرحله ریشه زایی E. sideroxylon به دست آمد. در این تحقیق نیز هنگامی که اکسینها به تنهایی یا به صورت ترکیبی استفاده شدند، در ریشه زایی گیاهان اثرات متفاوتی داشتند.

     در آخرین مرحله، گیاهکهای ریشه دار شده در پیت استریل بازکاشت شدند و در محفظه طراحی شده که دارای رطوبت بیش از 90 درصد بود، قرار گرفتند. رطوبت این محفظه به تدریج تا حدود 65 درصد کاهش یافت و به این ترتیب گیاهچه ها ی جوان، مرحله سازگاری خود را سپری نموده و با حدود 2/75 درصد زنده مانی به گلخانه منتقل شدند.

منابع مورد استفاده

-         Allemand| P. and E. Berninger 1985. Frost damage to ornamental trees and shrubs of the Mediterranean cost-line.  P. H. M. -Revue-Horticole| No. 259| 45-48.

- Anonymous| 1981.  Eucalypts for planting.  FAO| Rome| 677 pages.

-         Barnard| R. C. 1963.  The garden cultivation of Eucalyptus.  R. C. Barnard| Bovey Tracy| Devon| 8 pages.

-         Bazzocchi| R.; M. E. Giorgioni and S. Calzolari 1987.  Eucalyptus for cut foliage production.  Colture-Protette| 16 (6) 27-32.

-         Cheng| B.; C. M. Peterson and R. J. Mitchell 1992.  The role of sucrose| auxin and explant source on in vitro rooting of seedling explants of Eucalyptus sideroxylon.  Plant Science| 87: 207-214.

-         Curir| P. C.; P. Esposito and B. Ruffoni 1986.  Propagazione in vitro de Eucalyptus gunnii edi Eucalyptus stuariana.  Annali dell Instituto Sperimentale per la Floricoltura| 17: 73-84.

- DeFossard| R. A. 1974.  Tissue culture of Eucalyptus.  Australian Forestry| 37: 43-54.

-         DeFossard| R. A.; B. M. T. Bennett; J. R. Gorst and R. A. Boune 1978.  Tissue culture propagation of Eucalyptus ficifolia.  Combined Proceeding International plant Propagation Society| 28: 427-435.

- Forrest| M. 1991.  Post-harvest treatment of cut foliage.  In: Fifth International Symposium on Postharvest Physiology of Ornamental plants.  Importance of Cold in Ornamental Horticulture| Nice| France| 11-15 March 1991.  Acta-Horticulture| No. 298| 255-261.

-         Gill| R. I. S. and S. S. Gill 1994.  In vitro exudation of phenols in Eucalyptus.  Indian Forester| 120: 504-509.

- Ikemori| Y. K. 1987.  Epicormic shoots from the branches of Eucalyptus grandis as an explant source for in vitro culture.  Commonwealth Forestry Review| 66: 351-356.

-         Lloyd| G. and B. McCown 1980.  Use of micro culture for production and improvement of Rhododendrom spp.  HortScience| 15: 416.

- Murashige| T. and F. Skoog 1962.  A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture.  Physiologia Plantarum| 15: 473-497.

-         Muir| N. 1978.  A touch of the exotic.  GCandHTJ 1978| 183 (19) 14-17.

-         Robinson| D. W. 1992.  Selection of Eucalyptus species for garden use in cool temperature conditions.  In: International Symposium on selection and breeding of woody ornamentals| 29 June-2 July 1992| Angers| France.  Acta-Horticulturae| No. 320| 25-31.

- Rumine| P. and M. Bellandi 1989.  Eucalyptus for the production of cut green foliage.  Colture-Protette| 18 (5) 91-94.

Seneviratne| P.; A. W. Flegman; G. As. Wijesekara 1995.  The problem of surface sterilisation of shoot materials of Hevena.  Journal of the Rubber Research Institute of Sri-Lanka|  75: 51-60.

Micropropagation of ornamental Eucalyptus gunnii through in vitro culture

M. H. Assareh1 and H. Sardabi¹

     The role of E. gunnii as an ornamental tree for both landscaping and decorating flower bands has gained a great reputation which is due to cordate to orbicular shape and glaucous colour of its juvenile leaves| long vase life of its cut foliage and its attractive and heavy crown.  Vegetative propagation plays a significant role in improvement programs with Eucalyptus gunnii.  Traditional asexual propagation methods are not effective due to difficulties in production or proliferation of adventitious roots.  Unique traits of elite genotypes can be transmitted through in vitro micropropagation.  Various types of explants were examined in different experiments| including shoot tips| axillary buds| lignotuber and epicormic shoots.  Several experiments to determine the best disinfectant chemical| appropriate conditions and materials to prevent phenolic compound exudation| explant characteristics| media type and cytokinin auxin ratio were carried out.  Epicormic shoot explants in DEU medium at 0.5 mg L^-1 of Kinetin with 0.01 mg L^-1 of NAA gave better rate of adventitious shoot production with fewer calluses.  The highest adventitious root obtained with a mixture of NAA and IBA at 0.5 mg L^-1 each.  Micropropagation of plantlets were successfully hardened and adapted either in the propagator or in the greenhouse with survival rate of 75.2 %.